분자유전학실험

13주. 유전자 분석 기초 1: 유전자 분석 프로그램 활용 기초

서론 (Introduction)

유전체학의 눈부신 발전 과정을 통해 현재 많은 생물체들의 게놈 염기서열 분석이 완료되었고, 이를 통해 규명된 광대한 유전체 정보의 데이터베이스(DB)들이 웹사이트를 통해 연구자들에게 제공되고 있다. 이러한 DB의 가장 대표적인 종류는 미국 국립생물정보센터(NCBI)로서, 현재까지 밝혀진 게놈 정보들의 대부분을 이 데이터베이스를 통해 확인 및 분석이 가능하다. 한편, 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thanliana)의 경우 또한 독립적인 사이트(www.arabidopsis.org)를 통해 애기장대 게놈의 전체 염기서열 및 유전자들에 대한 다양한 데이터베이스들이 제공되고 있으며, 또한 이와 관련된 다양한 분석 tool 역시 제공되고 있는 상황이다. 본 실습은 이러한 애기장대의 데이터베이스를 이용하기 위한 기초 과정으로서, 기초적인 데이터베이스 활용법을 습득하고, 이러한 데이터베이스로부터 추출된 정보들을 어떻게 실제 연구 과정에 이용할 수 있는지를 유전자 분석 프로그램 활용을 통해 실습함으로써 유전자 분석의 기초를 익히고자 한다.

2. 재료 및 기구 (Materials and Apparatus)

인터넷이 연결된 실습 컴퓨터 (D309)

유전자 분석 프로그램 : SERIAL CLONER 2.6

USB 저장 장치

3. 실험 방법 (Methods)

<애기장대 DB 및 Serial Cloner 프로그램 활용 : DNA 구조 비교 분석>

① 애기장대 DB 웹사이트에 (www.arabidopsis.org; TAIR) 들어간 후, 웹사이트 구성 요소를 간단하게 설명 및 확인한다.

② 최상단 검색창에 유전자 이름 또는 유전자 좌위(locus)명을 입력한 후 검색한다. (예: ARF또는 AT1G04250)

③ 검색 결과 중 해당하는 유전자를 찾아 좌측의 locus (예: AT1G04250) 버튼을 클릭한다.

④ 제공되는 정보들을 확인 후, Map Links 중 Sequence Viewer를 클릭한다. 이후 노란색으로 표시된 Locus 정보창에서 맨 아래 nucleotide seq view를 클릭한다.

⑤ 게놈상의 유전자 Locus 위치를 확인한 후 마우스로 드래그하여 복사한다. 복사한 염기서열을 SerialCloner 프로그램상에 Untitled Sequence #1 창에 복사하여 넣는다. 만약 유전자의 방향이 반대로 되어있다면, 전체 염기서열을 드래그한 후 메뉴>Sequence>Antiparallel을 클릭하여 유전자의 방향을 바로잡는다. 이후 이 염기서열을 “유전자명(gDNA-1)”로 SAVE AS 형태로 저장한다. 결과물이 “유전자명(gDNA-1).xdna”로 나타날 것이다.

⑥ 다시 TAIR 사이트의 유전자 정보창에서 “Nucleotide Sequence”중 full length CDS, full length cDNA, full length genomic, 이 세 버튼을 각각 클릭해서 염기서열을 드래그한 후 ⑥과 같은 방식으로 새 창을 띄워서 붙인 후에 염기서열을 저장한다. 각각 “유전자명(CDS)”, “유전자명(cDNA)”, “유전자명(gDNA-2)”로 이름을 명명한다.

⑦ 인터넷 브라우저에서 https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo 로 이동하여 Clustal Omega 실행하여 입력). 이 때, “PROTEIN” 창을 열어서 “DNA sequence”로 바꾸어 설정한다. 이후 각 염기서열을 각 제목 아래쪽에 Copy Formatted-복사해서 넣고, STEP 2에서 output format을 Clustal w/ numbers로 한 후, Submit 한다.

⑧ 결과화면을 드래그하여 복사한 후, “메모장” 프로그램을 열어서 복사해 넣은 후 저장한 후 프린트한다 --> <결과 1>

<애기장대 DB 및 Serial Cloner 프로그램 활용 : GATEWAY cloning>

① Serial Cloner 프로그램에서 “유전자명(CDS)”, “attB1”, “attB2” 창을 띄운 후에, “유전자명(CDS)”창의 Locked를 클릭하여, 붙여넣기가 가능하도록 unlock한다. attB1 염기서열을 복사해서 유전자명(CDS) 염기서열 앞쪽에 복사해 넣고, attB2 서열은 유전자명(CDS) 뒤쪽에 복사해 넣는다. 이후 이 창을 “attB-유전자명”으로 저장한다.

② 메인 메뉴에서 Recomb.를 클릭한 후, BP reaction으로 가서 Expression Clone을 ①에서 생성한 “attB-유전자명”으로 설정하고, DONOR vector를 pDONR207(Circular)로 설정한 후, Do BP Reaction을 클릭한다. 이 때 나온 결과물을 “pDONR207-유전자명”으로 저장한다.

③ 다시, Rcomb.의 LR reaction으로 가서 ENTRY vector를 ②에서 저장한 “pDONR207-유전자명”으로 설정하고, DEST vector를 “pMDC43(Circular)”로 설정한 후, Do LR Reaction을 클릭한다. 이 때 나온 결과물을 “pMDC43-유전자명”으로 저장한다.

④ ②, ③의 결과물인 “pDONR207-유전자명”, “pMDC43-유전자명” 창에서 Graphic Map을 클릭한 후 Unique Sites를 언락하고, Particular sites를 클릭한 후 오른쪽 Choose site에서 다음의 제한효소 사이트를 클릭하여 지정한다.

ApaI, BamHI, ClaI, EcoRI, HpaI, NcoI, NruI, SacI, SmaI, XbaI

이 때 나온 결과물인 “Graphic Map of ....”를 File/Save Graphic Map As...를 클릭하여 저장한다. 결과물은 비트맵 그림 파일로 저장된다.

⑤ pDONR207(Circular)와 pMDC43(Circular)창을 열고 ④와 같은 방식으로 제한효소 site를 지정하고, Graphic file을 저장한다.

⑥ ④, ⑤의 결과물을 워드프로세서 또는 한글 파일에서 비교 편집하여 프린트한다. --> <결과 2>

⑦ 그래픽 파일 결과를 보고 클로닝한 DNA 부위를 절단할 수 있는 제한효소를 선별한다. 이후 메인메뉴에서, Virtual Cutter를 선택한 후 해당 제한효소를 지정하고, Select Sequence에서 “pDONR207-유전자명”, “pMDC43-유전자명”을 선택하여, 결과물을 확인하고, Copy Graphic Report를 클릭한 후 워드에 저장한 후, 프린트한다 (또는, Save Graphic Report를 한 후 저장 파일을 열어서 프린트한다)  --> <결과 3>

4. 결과 및 고찰 (Results and Discussion)

<결과 1> 유전자 구조 분석 : gDNA-1, gDNA-2, cDNA, CDS 염기서열 비교 alignment

<결과 2> 클로닝된 “pDONR207-유전자명”, “pMDC43-유전자명”과 벡터 구조의 제한효소

지도 비교 분석

<결과 3> 제한효소 전기영동 결과 예상 절편 크기 및 전기영동 가상 결과 그림

<고찰>

① <결과 1>, <결과 2>, <결과 3>을 분석하여 설명하시오.

② 본인이 분석한 유전자를 제외하고, 인트론이 있는 유전자를 하나 무작위적으로 선별하여, <결과 1>을 도출하시오.